بهار نیوز - NGS: فناوری‌های نوین ژنتیک در تشخیص و درمان

مقدمه‌ای بر فناوری NGS
NGS “Next Generation Sequencing” یا توالی یابی نسل جدید مجموعه ای از دستگاه‌ها و نرم افزارهای لازم برای خوانش آنچه که در توالی DNA ما می‌گذرد فراهم آورده است تا به وسیله آن متخصصان بتوانند حتی بیماری‌ها با علت ناشناخته را تشخیص دهند و یا در انتخاب بهترین درمان برای سرطان‌ها اقدام کنند.
علم ژنتیک امروزه بیشترین مقالات را در زمینه‌های پژوهشی به خود اختصاص داده است و بنابراین طبیعی است که شاهد پیشرفت این علم با سرعت باورنکردنی باشیم. در ادامه قصد داریم در ابتدا از الفبای این علم که شامل ساختمان ژنتیک، تغییر و ارتباط آن با بیماری‌ها است به تازه ترین پیشرفت‌ها در این حوزه و نحوه تشخیص این تغییرات از طریق به روز ترین روش‌ها همچون روش‌های NGS و کاربردهای آن در زندگی بشر بپردازیم.

قد بلند و قدکوتاه سفید پوست یا سیاه، چشم آبی یا قهوه ای مو بلوند یا مشکی باهوش و خلاق یا بی استعداد و تنبل..!!!!
تمام این ویژگی‌ها در ژنتیک شما نهفته است. دریافتن این مطلب که چگونه ژن‌های ما پدید آورنده تمام این ویژگی‌ها از جمله ویژگی‌های ظاهری و یا اخلاقی و یا حتی سالم و یا بیمار شدن ما هستند خود به دانشی بسیار جذاب به اسم علم ژنتیک تبدیل شده است که امروزه پژوهشگران و دانشجویان بسیاری را با خود همراه کرده است.
کوچکترین ساختمان سازنده موجودات زنده یعنی سلول شامل توالی‌های DNA که به صورت فشرده تنها بخشی از حجم یک سلول را به خود اختصاص می‌دهند تشکیل شده است. این توالی‌های DNA تمامیت حیات را در خود جای داده اند و کنترل بسیاری از رخدادها از جمله بیمار شدن و یا نشدن یک فرد در طول زندگی، میزان پیشرفت یک بیماری در فرد،تاثیر متفاوت یک دارو در افراد مختلف که به پزشکی شخصی (Personalized medicine) شناخته می‌شود همه و همه را در دست دارند.

به طور کلی می‌توان گفت که موجودات زنده از سلول‌هایی تشکیل شده اند که هر سلول یوکاریوتی حامل یک هسته است که ساختار ژنتیکی ما را در خود جای داده است. DNA تمام اطلاعاتی را که برای تولید انسان ضروری است، مانند یک کتابچه راهنمای دستورالعمل، ذخیره می‌کند. با تبدیل مولکول‌های DNA به RNA طی فرآیند رونویسی اطلاعات ذخیره شده در DNA قابل استفاده می‌شوند. به بخش‌هایی از DNA که به RNA رونویسی شده، مناطق کد کننده یا ژن می‌گویند.
بنابراین، RNA‌ها اطلاعات DNA را به خارج از هسته منتقل می‌کنند. این مولکول‌های پیام رسان در ادامه برای ساخت پروتئین طی فرآیند ترجمه در دسترس اندامک ریبوزوم قرار می‌گیرند. پروتئین‌ها از اسیدهای آمینه تشکیل شده اند و تقریباً تمام عملکردهای ساختاری، تنظیمی و انتقال سیگنال را در بدن به عهده دارند.
بنابراین، RNA‌ها و در نتیجه پروتئین‌‌ها، واسطه‌‌های ضروری آنچه در DNA راهنمای دستورالعمل ما نوشته شده است هستند. این که کدام بخش از DNA به RNA رونویسی می‌شود و در نهایت به پروتئین ترجمه می‌شود، بسته به نوع تمایز هر سلول، بین انواع مختلف سلول‌ها متفاوت می‌باشد. بنابراین، برای مثال، یک سلول مغزی (نورون) الگوی بیان ژن متفاوتی را نسبت به سلول کبدی (هپاتوسیت) نشان می‌دهد.

DNA مخفف دئوکسی ریبونوکلئیک اسید، یک ماکرومولکول متشکل از واحدهای نوکلئوتید می‌باشد. ستون فقرات DNA از مولکول‌های متناوب تشکیل شده است: دئوکسی ریبوز و فسفات که با نوکلئوبازهای مهم A (آدنین)، C (سیتوزین)، G (گوانین) و T (تیمین) که به دئوکسی ریبوز متصل شده اند، تکمیل می‌شود.

مولکول DNA دو رشته ای، موازی و نا هم سو جهت گیری شده و به صورت مارپیچ سه بعدی سازماندهی شده است. حال تغییر در هر یک از این نوکلئوتیدها از جمله جابه جا شدن آن‌ها با یک نوکلئوتید دیگر یا حذف شدن و یا اضافه شدن تعدادی از آن‌ها به توالی DNA جهش نامیده می‌شود که در برخی از موارد تاثیرات مخربی از جمله ایجاد بیماری در فرد را به همراه دارد.
بنابراین برای تشخیص این تغییرات برروی توالی DNA از روشی به نام توالی یابی Sequencing بهره می‌برند که در طی آن تک تک نوکلئوتیدهای تشکیل دهنده یک ژن خوانش شده و در حقیقت رمز ژنتیکی هر فرد قابل شناسایی است. در این فرآیند، سطوح مختلف داده‌ها، از مشاهدات بالینی منفرد تا مجموعه داده‌های مولکولی پیچیده، مورد بررسی قرار می‌گیرند تا رویکردی که به عنوان "پزشکی سیستمی" “systems medicine” شناخته می‌شود را درتوسعه روش‌های درمانی یاری رساند.

توالی یابی اسید‌های نوکلئیک با تکنولوژی نسل اول و دوم
در روش‌های توالی یابی نسل اول همچون روش سنگر که اولین بار در سال 1977 میلادی معرفی شد امکان رمزگشایی توالی‌های کوچکی از DNA در هر بار خوانش فراهم شد. در سال‌های آتی این روش با کمی پیشرفت اساس توالی یابی ژنوم (کل محتوای ژنتیکی یک فرد) قرار گرفت که به وسیله آن ژنوم انسان با سه میلیارد نوکلئوتید را طی سیزده سال به صورت موازی در چندین مرکز جهان با هزینه ای بالغ بر سه میلیارد دلار توالی یابی کردند.
به دست آوردن چیدمان آرایش بازی ژن‌های انسان برای اولین بار در جهان پیشرفتی عظیم در علم ژنتیک را رقم زد که به موجب آن این اندیشه که با آن بتوان تک تک افراد را منحصرا توالی یابی و شناسنامه ژنتیکی فردی برای هر شخص در نظر گرفت را در ذهن دانشمندان شکوفا نمود. اما برای دستیابی به این هدف نیاز به روشی است که در مدت زمان کمتر با هزینه ای بسیار پایین تر ژنوم هر فرد را توالی یابی کند.

این روش‌ها که به نسل‌های دو و سه توالی یابی معروف هستند و به اصطلاح توالی یابی نسل بعد Next Generation Sequencing (NGS) نامیده می‌شوند قادرند در مدت زمان بسیار کمی بین دو هفته تا حتی دو ساعت با هزینه ای حدود 1000 دلار توالی ژنتیکی هر فرد را رمز گشایی کنند.
از زمان تکمیل پروژه ژنوم انسان در سال 2003، پیشرفت شگفت انگیزی در فناوری‌های توالی یابی صورت گرفته است.با اینکه تعداد و تنوع ژنوم‌های توالی یافته به طور چشمگیری افزایش یافت با این حال هزینه توالی یابی هر مگاباز کاهش داشته است. در طول 5 سال گذشته، توالی یابی نسل بعدی (NGS) از تحقیقات به سمت استفاده در مقاصد بالینی منتقل شده است. حداقل 14 کشور توالی یابی را برای جمعیت‌های بزرگ آغاز کرده اند و پیش بینی می‌شود که تا سال 2025 بیش از 60 میلیون نفر در سراسر جهان توالی ژنوم خود را تعیین کنند.

کاربرد‌های فناوری NGS
از جمله مهمترین کاربردهای NGS می‌توان به توالی یابی مولکول‌های DNA و RNA اشاره کرد که علاوه بر شناسایی توالی‌های جدید در این مولکول‌ها کمک به تشخیص جهش‌ها،شناسایی برهم کنش بین توالی‌های DNA و پروتئین،میزان بیان ژن‌ها و حتی تغییرات اپی ژنتیکی خواهد کرد. از این رو، داده‌های خروجی NGS بینش خوبی در مورد ویژگی‌های ساختاری و عملکردی سلول‌ها و بافت‌ها در اختیار ما قرار می‌دهد.
کاربردهای معمول روش‌های NGS در میکروبیولوژی و ویروس‌شناسی، علاوه بر توالی‌یابی کل ژنوم با کارایی بالا، کشف میکروارگانیسم‌ها و ویروس‌های جدید با استفاده از رویکردهای متاژنومی، بررسی جوامع میکروبی در محیط و در جایگاه‌های بدن انسان در شرایط سالم و بیماری است. NGS در میکروبیولوژی مواد غذایی نیز با تعیین توالی کل ژنوم یک کلنی از باکتری، یک ویروس و یا هر ارگانیسم دیگری که معمولاً به عنوان "متاژنومیکس" شناخته می‌شود کاربرد دارد.

NGS همچنین درآزمایشگاه‌های پزشکی قانونی به آزمايشگران این اجازه را مي‌دهد تا داده‌هايی که کل ژنوم انسان را در بر مي‌گيرد دستیابی پیدا کرده و به طيف وسيع‌تري از سؤالات پاسخ دهند. علاوه بر این، تکرار پشت سر هم کوتاه (STR) توالی یابی شده توسط NGS کاملاً با فرمت‌های پایگاه داده فعلی سازگار هستند. توالی یابی نسل بعدی (NGS) کاهش قابل توجه هزینه‌های پروفایل و تجزیه و تحلیل ژنومی، دسترسی به راه‌های متعددی را در بخش دارویی و تشخیصی، به ویژه در حوزه پزشکی شخصی، فراهم کرده است.
از روش‌های NGS همچنین برای تشخیص پیش از تولد نیز استفاده می‌کنند. در این روش در چند ماهه اول بارداری خون مادر را گرفته و DNA‌های جنینی آزاد شده در آن cell-free fetal DNA (cffDNA)) را جدا و با روش‌های NGS توالی یابی می‌کنند. به کمک این روش ناهنجاری احتمالی جنین را پیش تولد می‌توان تشخیص و اقدام مناسب را انجام داد. از جمله مزایای این روش می‌توان به غیر تهاجمی بودن آن بدون آسیب رسیدن به جنین،سرعت و توان بالای عملیاتی اشاره کرد.
از جمله روش‌های توالی یابی انجام شده با NGS یکی توالی یابی کل ژنوم (WGS) بوده که از جمله پرکاربردترین شکل NGS است و به تجزیه و تحلیل کل توالی نوکلئوتیدی یک ژنوم می‌پردازد. از طرف دیگر توالی یابی کل اگزوم (WES) شکلی دیگر از توالی یابی هدفمند است که فقط به توالی یابی اگزون‌های کد کننده پروتئین می‌پردازد.

مراحل اساسی در NGS کدامند؟
توالی یابی نسل بعدی شامل سه مرحله اساسی است: آماده سازی کتابخانه، توالی یابی و تجزیه و تحلیل داده‌ها.
براساس روش به کار گرفته شده برای توالی یابی می‌بایست در ابتدا قطعات برای خوانش آماده شوند. مراحل آماده سازی شامل قطعه قطعه کردن توالی‌های DNA و اضافه کردن توالی‌های معلوم به نام آداپتور به هر دو انتهای قطعات می‌باشد. این قطعات با روش‌های گوناگون بر پایه PCR تکثیر شده و یک کتابخانه را تشکیل می‌دهند. در ادامه هر کتابخانه توالی یابی شده و در نهایت حجم عظیمی از داده‌های توالی یابی شده در یک فایل جهت انجام آنالیزها به دست درخواست کننده می‌رسد.
فناوری توالی یابی نسل بعدی یا NGS یک فناوری توالی یابی موازی انبوه است که به عنوان یک روش High throughput با سرعت فوق العاده بالا عمل می‌کند. فناوری NGS برای تعیین توالی نوکلئوتیدهای ژنوم در سطح DNA و یا RNA کاربرد دارد. دستگاه‌های متعددی برای انجام این عمل طراحی شده اند که هر یک مسیر‌های مختلفی را برای رسیدن به توالی کل ژنوم به کار گرفته اند. جدای از این گوناگونی و تحول روز به روز این روش‌ها و دستگاه‌ها بخش چالش برانگیز نهایی آنالیز خروجی حاصل از آن‌ها می‌باشد.

طبیعی است که آنالیز خروجی روشی همچون سنگر یک فایل ساده با تنها یک توالی است در حالی که در روش‌های NGS خروجی نهایی شامل میلیون‌ها قطعه از جای جای ژنوم می‌باشد. در نتیجه با اینکه روش‌های NGS با ابداع دستگاه‌های بسیار کارآمد زمان و هزینه توالی یابی بسیار کاهش داده اند ولی برای حصول یک نتیجه نهایی قابل قبول و راضی کننده بخش نهایی کار یعنی آنالیز انبوه داده‌های NGS از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است.
دستگاه‌های توالی یاب در این زمینه به ندرت در ایران یافت می‌شوند و محققان اغلب توالی‌های خود را برای سکانس به دیگر کشورها فرستاده و تنها نتایج نهایی توسط خود آن‌ها آنالیز می‌شود. در این زمینه نیز محققان علم بین رشته ای بیوانفورماتیک با بهره گیری از علوم مهندسی کامپیوتر نرم افزارهای بسیار کاربردی و راه گشا در این زمینه را خلق کرده اند که امکان مدیریت داده‌های عظیم و یا به اصطلاح Big data را برای محققان حوزه بیولوژی فراهم آورده است.

از جمله سرفصل‌های آنالیز داده‌های NGS شامل:
•   ارزیابی کیفی فایل FASTQ و Trimming آن
•   هم ردیف سازی (Alignment) سکانس‌ها با ژنوم مرجع
•   فراخوانی واریانت‌ها (Variant Calling)
•   برگزینی واریانت عامل بیماری زایی به کمک گایدلاین‌های فیلتراسیون
امروزه یادگیری آنالیز داده‌های NGS به مراتب با ارزش تر است چرا که به تصمیم گیری انسانی وابسته بوده و به کمک ماشین‌ها به طور اتومات قابل انجام نمی باشد. نیازجامعه به آنالیزورهای با تجربه در حیطه NGS روز به روز در حال افزایش است که بازار کار بسیار خوبی را نیز برای این عده به همراه دارد.
در این حوزه آزمایشگاه ژنیران به عنوان یکی از معدود مراکز موجود در کشور آموزش حضوری آنالیز داده‌های NGS را برای علاقه مندان به این علم نوین فراهم آورده است که دانشجویان پس از گذراندن این دوره بر اساس قابلیت‌های فردی خود می‌توانند در همین مرکز به عنوان آنالیزور استخدام شوند.

انجام خدمات توالی یابی اسید‌های نوکلئیک
همچنین در این حوزه آزمایشگاه ژنیران از مرحله استخراج نمونه‌های RNA و DNA، ارسال نمونه‌ها برای توالی یابی تا آنالیز داده‌های NGS از مرحله FASTQ و در نهایت گزارش نویسی بالینی خدمت رسانی می‌نماید.